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Magische Unterwasserwelt mit HiTec Fluoreszenz Teil 2 © Text und Bildmaterial Prof. Dr. Horst Grunz

Was versteht man unter Fluoreszenz?

Die Bezeichnung Fluoreszenz leitet sich von dem Mineral Fluorit (Calciumfluorit, CaF) ab. Dieses Mineral leuchtet im UV-Licht gelblich-grün. Die Bestrahlung bestimmter Objekte mit kurzwelligem Licht führt zur Abstrahlung von langwelligerem, sichtbaren Licht. Manchmal wird UVLicht (Wellenlänge unter 280 nm) verwendet, das dann als „Schwarzlicht“ bezeichnet wird, weil es für das menschliche Auge unsichtbar ist. Solches Licht wird häufig in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet. Unter diesen Bedingungen leuchten bestimmte Farbträger im Zellgewebe (auch experimentell an Zellstrukturen gebunden) in bestimmten Farben.

Abb. 5 Fluoreszenz ist ein Phänomen, bei dem kurzwelliges Licht von bestimmten Objekten absorbiert wird und als langwelligeres Licht zurückgeworfen wird

1. Energie (hier blau) wird von Elektronen eines Fluoreszenzmoleküls absorbiert

2. Die Photonen springen auf ein höheres Energieniveau

3. Sofort fällt das Elektron zurück auf ein niedrigeres Energieniveau, wobei langwelligeres Licht (hier rot) abgegeben wird

Jedoch für die Fluoreszenz bei Korallen und anderen Tieren oder Pflanzen wie Algen, Fische oder Nichtwirbeltieren (Invertebrata) wie Schwämme, Schnecken, Krebse. etc. ist extremes kurzwelliges Licht nicht geeignet. Es zeigte sich, dass blaues Licht (450-470 nm) die besseren Ergebnisse lieferte. Viele Bewohner der Riffe „glühen“ in verschiedenen Farben des Regenbogens in Abhängigkeit der artspezifischen GFP-verwandten Eiweiße.
Fluoreszenz sollte nicht mit Phosphoreszenz verwechselt werden. Phosphoreszenz ist eine besondere Form von Lumineszenz. Während Fluoreszenz sofort endet, wenn die Beleuchtung abgeschaltet wird, leuchten phosphoreszierende Objekte Sekunden bis Stunden nach.

Fluoreszenz-Technik Vorausetzungen

Für die Erzeugung und Dokumentation fluoreszierender Objekte sind spezielle technische Voraussetzungen erforderlich. Ähnlich wie bei Untersuchungen mit dem Fluoreszenzmikroskop in der Zellbiologie sind folgende technische Ausstattungen notwendig:

1. energiereiche HiTec Fluoreszenzquelle (Emission)

2. Fluoreszierendes Objekt (Target)

3. Spezialfilter für die Analyse (Sperrfilter)

zu 1. kurzwelliges Licht (hier 450 - 470 nm) wird auf die Objekte gerichtet (Korallen, Fische und Nicht-Wirbeltiere („niedere“ Tiere)

zu 2. das fluoreszierende Objekt wirft längerwelliges Licht zurück (gelb,grün,rot)

zu 3. damit sich das blaue Licht nicht mit den Regenbogenfarben vermischt, wird ein Gelbfilter (Sperrfilter) vor die Maske und die Kamera plaziert, der nur Licht mit einer Wellenlänge größer als 500 nm passieren lässt.

Abb. 6 Ausstattung für Fluoreszenz-Tauchgänge

a, b Fluoreszenzleuchten

a: ausgestattet mit blauen HiTec LEDs und zusätzlichen Sperrfilter b: arbeitet mit weißen LEDs. Ein Spezialfilter blockiert nicht alle Wellenlängen unterhalb von 500 nm

c gelbe Sperrfilter, die sowohl vor der Maske als auch vor der Fotoapparatur (Camcorder oder Stillkamera) plaziert werden.

Was versteht man unter Biolumineszenz?

Bei Biolumineszenz handelt es sich um ein Phänomen, das durch chemische Prozesse innerhalb eines Organismus hervorgerufen wird. Es wird auch als kaltes Licht bezeichnet. Man findet es in Dinoflagellaten, in bestimmten Bakterien und Glühwürmchen (in Wirklichkeit ein Käfer mit einem Leuchtorgan am Hinterleib). Mindestens zwei wichtige chemische Substanzen spielen bei der Lichterzeugung eine Rolle, das Luziferin und das Enzym Luciferase. Durch die Katalyse mit Luziferase kommt es zur Umwandlung von Luziferin in Oxiluziferin. Dabei wird grün-gelbes Licht freigesetzt. Bakterien mit dem Luziferin-Luziferase-System finden sich auch in der Laterne des Tiefseeanglerfisches (Melanocetus johnsonii), der so seine Lieblingsspeise Tiefseetintenfische anlockt.

Abb. 7 Bei Biolumineszenz handelt es sich um kaltes Licht, das innerhalb eines Organismus (bestimmte Bakterien, Flagellaten und Leuchtkäfer) durch biochemische Prozesse hervorgerufen wird.

a. Mindestens zwei chemische Substanzen sind erforderlich, Luziferin und Luziferase. Das Enzym Luziferase katalysiert die Oxidation von Luziferin. Dadurch kommt es zur Bildung von inaktivem Oxiluziferin und der Freisetzung von kaltem Licht. Für die Wiederholung der Prozesse und erneutes Leuchten ist die Zuführung von frischem Luziferin erforderlich, das durch interne Stoffwechselprozesse oder durch die Nahrung erneuert wird.

b. in einigen Fällen bildet Luziferin zusammen mit einem Protein (äquivalent zu Luciferase) ein Photoprotein. Der Lichteffekt wird dann durch Calciumionen ausglöst.

c. Tiefseeanglerfische Melanocetus johnsonii besitzen eine bewegliche „Laterne“, mit der sie Beutetiere anlocken. Diese Biolumineszenz stammt von der Symbiose mit Bakterien, die das Luziferin/Luziferase-System besitzen.

Bedeutung von GFP (Grün Fluoreszierendes Protein) und seiner Derivate

Erstmals wurde das GFP in der Meduse Aequorea victoria identifiziert. Im blauen Licht zeigt die Qualle grün-gelbe Fluoreszenz. In der Molekularbiologie, Zellbiologie und medizinischen Grundlagenforschung kann das Gen für GFP an andere Gene gekoppelt werden, die für Eiweiße codieren, deren Funktion im lebenden Organismus (ganzes Tier oder Zellkulturen) studiert werden sollen. So ist es z.B. möglich die Wanderung und die Position von bestimmten Zellen innerhalb eines lebenden Embryos zu verfolgen. Daher ist diese Technik ein Meilenstein der modernen Zellbiologie einschließlich Krebsforschung. Sehr spektakulär (aber vom wissenschaftlichen Standpunkt weniger bedeutsam) war die „Erleuchtung“ ganzer Tiere wie Fliegen, Fische, Frösche (Axolotl Ambystoma mexicanum, mexikanische neotene Molche), Mäuse, Ratten, Kaninchen und Schweine unter Fluoreszenzanregung. Das „klassische“ GFP fluoresziert bei einer Wellenlänge von 509 nm. Roger Tsien, einer der 3 Nobelpreisträger, hat das GFP in der Weise modifiziert, daß die Derivate in allen Farben des Regenbogen leuchteten (Abb. 9). Die verschieden Farben gehen auf Modifikationen der Aminosäure-Konfiguration im Inneren der faßähnlichen ß-Struktur des Proteins zurück (Abb. 8). Solche GFP-ähnlichen Eiweiße findet man in artspezischer Weise in den verschieden Korallenarten. Das ist der Grund dafür, dass kurzwelliges Licht (bevorzugt blau) diese Tiere in magischem Licht erstrahlen lassen. Das Emissionsspektrum ist ganz unterschiedlich in den verschiedenen Korallenarten (Abb. 11).

Abb. 8 Struktur des Grün-fluoreszierenden Proteins (GFP)

Es wurde erstmals in einer Qualle identifiziert. Das Molekül im Zentrum (rechts vergrößert dargestellt) des korbartigen Proteins (violett) ist verantwortlich für die grüne Fluoreszenz bei Bestrahlung mit kurzwelligem Licht.

Abb.9 Modifiziertes GFP vergleichbar mit den verschieden Chromophoren in den Korallen

Monomere oder Tandem-dimerische Proteine abgeleitet von Aequorea GFP or Discosoma RFP, wurden in Bakterien exprimiert und gereinigt (angereichert). Das Foto zeigt die Fluoreszenz, angeregt durch verschiedene Wellenlängen und betrachtet mittels verschiedener Sperrfilter (modified after Tsien, 2009 Nobel Prize lecture)

Abb. 10 Sequenzausrichtung von GFP und Anthozoa FPs.

Die Bezeichnung der Aminosäureabkürzungen (Buchstaben) orientiert sich am GFP. Die N- und G-terminalen Bereiche sind nicht gezeigt. Korallen FPs sind mit kleinen Buchstaben kennzeichnet, die die Art ( sp. Species) andeuten (i.e. „z“ für Zoanthus sp., „am“ für Anemonia majano, „c“ für Clavularia sp., „dz“ für Discosoma sp. „rd“ für Discosoma sp. red, „as“ für Anemonia sulcata). Dargestellt ist die Sequenz der Proteine, die für die Fluoreszenz verantwortlich ist, i.e. gelb, gelb-grün, grün, rot. Identische Animosäuren sind mit waagerechten Strichen gekennzeichnet. aus: Nadya G Gurskaya, Alexander P Savitsky, Yurii G Yanushevich, Sergey A Lukyanov and Konstantin A Lukyanov Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis; BMC Biochemistry (2001) 2:6

Mögliche Bedeutung der GFP-ähnlichen Proteine der Korallen

Korallen (Anthozoa) gehören wie die die Medusen (Scyphozoa) und Hydropolypen (Hydrozoa) zu den Nesseltieren (Cnidaria). Ihr Aufbau besteht aus zwei Zellschichten (Epidermis und Gastrodermis, getrennt durch eine Membran (Mesogloea), die auf zwei embryonale Keimblätter, dem Entoderm und dem Ektoderm, zurückgehen. Das Gastroderm verantwortlich für die Verdauung, enthät die Symbionten (Algen, die zu den Dinoflagellaten - Zooxanthellen gehören). Sie sind Mitbewohner der Korallen und keinesfalls parasitisch. Im Gegenteil, sie sind lebensnotwendig für die Korallen, weil sie wichtige Stoffwechselprodukte mit Ihren Wirten austauschen. Sie verleihen den verschiedenen Korallen in unterschiedlicher Stärke eine braune Farbe. Die symbiontischen Algen versorgen die Korallenpolypen mit Kohlehydraten, Sauerstoff und Lipiden, die sie mittels Photosynthese produziert haben. In verschiedenen Publikationen wird irrtümlich behauptet, die Farbenpracht vieler Korallen stamme von den Symbionten. Es ist aber so, daß die GFP-verwandten Chromproteine für die wunderbare gelbe, grüne und rote Farbgebung verantwortlich sind. Sie befinden sich in der äußeren Zellschicht der Polypen, der Epidermis (Abb. 2). Sie könnten bei der Umwandlung von kurzwelligem Licht in das für die Photosynthese der Algen notwendige langwelligere Licht eine wesentliche Rolle spielen. Das könnte für Korrallen
bedeutsam sein, die tiefer als 5 Meter angesiedelt sind, wo nur noch die Blauanteile des Sonnenlichts vorhanden sind. Andere Wissenschaftler geben zu bedenken, dass Chromproteine bei Korallen Schutzfunktion gegen das UV-reiche Sonnenlicht ausüben, wenn sie nahe der Wasseroberfläche wachsen. Nicht völlig geklärt ist die Fähigkeit von Fischen, die die rote Autofluoreszenz von Artgenossen oder Fraßfeinden noch in Tiefen ab 15 Meter erkennen können. Das unbewaffnete menschliche Auge kann dagegen außer grün und blau keine anderen Farben mehr registrieren. Offensichtlich sind bei (bestimmten) Fischen die Kopf- oder/und Seitenlinien als Signale zum Erkennen von Feinden und für das Revierund Brutverhalten von zentraler Bedeutung.

Abb. 11 Haupttypen fluoreszierender Pigmente (FPs) in Korallenpolypen

Diese Pigmente werden in blauen, grünen, gelben und roten Kombinationen gefunden (a, b, c, d) mit überlappenden Exitationsund Emissionsspektren(e, f, g). a,e, Hauptsächlich Blau, in Acropora n o b i l i s . b , f , Hauptsächlich Grün, in Pocillopora damicornis. c,g, Emissionen von über lagernden Blau/ G r ü n u n d unterlagerndem Gelb FPs in der 'Sonne' Po r i t e s c y l i n d r i c a . Korallen Photosynthese Aktions-Spectrum (rote Kurve) bezeichnet die Energie mit einer Wellenlänge, die nicht für die Photosynthese verwendet werden kann. d, Tiefere Zonen - FPs bei green Montipora digitata.

modified after Anya Salih, Anthony Larku, Guy Cox, Michael Kühl & Ove Hoegh-Guldberg; NATURE | VOL 408 | 2000

 

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